纳米材料毒物动力学的总体情况

　　纳米颗粒（尤其是较小尺寸的纳米颗粒）能够穿透细胞膜屏障，使得颗粒材料的毒理学增加一个维度。纳米材料由于非常小的尺寸和一些表面特性，不溶或部分可溶的纳米颗粒可能能够到达一些预期之外的体内位点，而一般情况下这些位点可以依靠生物膜的保护而避免暴露于常规颗粒物质。纳米材料在整个生物体内的毒物动力学被视作毒理学研究的重要组成部分。经短时暴露累积在次级器官中的小部分纳米颗粒可能并不会体现出对健康的不利影响。但是，纳米材料可能会触发初级器官分泌效应调节介体，并释放到血液中。这些介体可能在心血管系统和其他部位诱发不良影响。此外在慢性暴露期间（例如，通过肺部或肠道），次级器官中的纳米材料浓度可能会积累到足以引发不良健康影响的程度（OECD2016d）。

　　相较于可溶性化学物质的吸收，纳米颗粒在不同器官之间的吸收可能存在较大差异，主要原因是纳米材料与（可溶性）物质在吸收和生物动力学行为方面受不同的过程支配。与多数分子基于扩散梯度驱动的转运不同，纳米颗粒是基于胞吞作用或其他主动（能量驱动的）跨细胞转运。单核吞噬系统（MPS）细胞能将颗粒从血液循环中清除，最终主要集中于富含吞噬细胞的器官，例如肝脏（Kupffer细胞）和脾脏（巨噬细胞）（Geraetsetal.,2014）。不可降解的颗粒一般无法代谢，但部分颗粒可能发生（缓慢）溶解（例如银纳米颗粒），最终逐渐形成离子和较小的颗粒。当颗粒发生（缓慢）溶解时，需同时考虑以可溶物质形式存在的溶解部分以及剩余颗粒部分的毒物动力学。对于溶解部分，经典暴露场景（以及后续的风险评估）可以参考SCCS关于化妆品原料的评估指南（SCCS/1602/18）。在纳米颗粒发生溶解之前，它的毒物动力学主要取决于纳米颗粒的颗粒性质，因此需要重点考虑纳米颗粒/材料可能发生溶解的位点（例如胃、小肠、肝）。潜在暴露途径对于溶解的可能性非常重要。纳米颗粒的分布可能是由载体介导的，因此可能受到表面蛋白冠形成和其他转化的影响。纳米材料的聚集和团聚可能使其跨生物屏障运输更为复杂。颗粒一般可以快速从血液中移除，主要分布于肝脏和脾脏，但也可能分布于肺部、大脑和睾丸（Geraetsetal.,2014）。例如，2005年Hougaard等人在一篇关于生殖作用的综述中提到，吸入暴露可能引起系统暴露。在任何情况下都不能从溶解态物质的毒物动力学推断该物质的纳米材料的毒物动力学，而需要通过实验测定。

　　OECDTG417（OECD,2010d）指南旨在非纳米材料的毒物动力学评估，根据该指南第9段所述，并不适用于评估纳米材料。经合组织近期的研讨会（OECD，2016d）总结到：该指南主要针对由扩散/灌注和代谢过程控制的化学品的毒物动力学，并不针对颗粒的毒物动力学，两者在吸收、分布和清除方面存在本质不同。一般认为OECDTG417（OECD,2010d）不适用于纳米材料，这是因为该准则所建议的暴露和暴露后观察的各时间点不再适合；没有考虑到测试项目准备以及吸入途径的其他相关方面；此外，暴露条件的较小变化也可能对动力学行为产生重大影响，特别是对于吸入相关研究，该准则在这方面未作充分考虑。

　　鉴于当前的动物试验禁令，系统暴露量的估算主要依靠测定跨体外生物屏障转运能力，例如经皮、经口和吸入的体外模型，以及所谓的纳米材料生理药代动力学（PBPK）模型。目前已经针对某些纳米材料开发了一系列生理药代动力学（PBPK）模型（例如，Bachleretal.,2013；Linetal.,2016；Hinderliteretal.,2010，以及文献中的其他模型）。国际标准化组织纳米技术委员会（ISOTC229）发表了一项关于纳米颗粒毒物动力学的概述（ISO/TR22019:2019纳米技术-纳米材料毒物动力学研究注意事项）。此外，经合组织目前正在考虑修订OECDTG417（OECD,2010d），增加纳米材料毒物动力学相关内容，或单独起草关于纳米材料毒物动力学的准则。但是，纳米材料的PBPK模型以及其他计算机模型工具仍处于初级阶段。

　　吸收量的测定/估计

　　化妆品原料的主要暴露途径有经皮、吸入和经口摄入，需了解是否会通过这些途径导致系统暴露。过去主要通过体内实验对血液、组织和排泄物进行化学分析来评估常规化妆品原料的系统暴露情况。体外模型能够提供物质潜在的跨生物屏障转运/吸收的信息。OECDTG428（皮肤吸收：体外方法，OECD，2004a）已经验证可用于评估常规化学品的皮肤吸收率。对于其他生物屏障，尚无已验证的相关准则用以估算其转运率，但有胃肠道和肺部的相关方法记载于相关文献中。

　　目前可以通过先进的2D（二维）和3D（三维）多细胞共培养体外模型评估纳米材料跨越不同生物屏障的的吸收，此类模型旨在高度模拟体内解剖结构以及体内器官和屏障功能，如肺、肺泡和胃肠道等。这些模型可以填补外部暴露和系统暴露之间的空白。此外，针对相关内部器官和屏障（例如肝、肾和血脑屏障）的体外模型可以提供一些关于潜在内部分布、代谢和排泄的信息。通过研究纳米材料在相关生物液体中的溶解速率或稳定性，可以了解该物质在摄入后是否仍以纳米形式存在，而存在形式决定了进一步的体内分布情况。

　　如果有数据说明纳米材料存在系统吸收，则需要进一步研究以确认所吸收的材料是以颗粒形式还是以溶解/代谢形式存在。如果无法通过实验数据或基于纳米材料的溶解度/降解来排除纳米颗粒的吸收情况，SCCS将采用默认方法，假定100％的吸收材料是以纳米颗粒形式存在。但是，这并不意味着颗粒形式的化学物质具有更大的潜在毒性。根据纳米材料的化学组成，某些材料的溶解/代谢形式可能比其颗粒形式更具毒性，在进行安全评估时必须考虑到这一情况。

　　无论经何种摄取途径进入人体，都会有一部分纳米颗粒被吸收至血液并出现系统分布。

　　目前已有可用的“生物动力学模型”，例如人体呼吸道模型（HRTM）和经口暴露的人体消化道模型（HATM）。这些模型结合PBPK/TK模型，可以计算系统暴露量、排泄量和组织吸收剂量（ICRP,2006年）。

　　途径一：经皮

　　纳米颗粒的经皮吸收和在人体内的转运效率可能取决于其颗粒尺寸（Bachleretal.,2015）。为了计算内部暴露量，实际暴露条件（外部暴露）下的颗粒尺寸分布需要与相似粒度的摄入率进行关联。因此，应使用一种具有纳米材料典型尺寸分布的配方进行皮肤渗透研究。

　　除使用手术中获得的人类皮肤外，也可以使用重建的人类表皮（RhE）模型获取跨皮肤转运数据。OECDTG439（OECD，2019a）方法（体外皮肤刺激）对该模型进行了介绍，并在近期用于医疗器械提取物皮肤刺激性的测定（DeJongetal.,2018）。

　　在进行经皮吸收的评估时，应遵循SCCS化妆品原料皮肤吸收体外评估的基本标准（SCCS/1358/10）以及OECDTG428（OECD，2004a）。但需注意的是，这些准则是为常规化学品而制定。如前所述，可以接受在动物试验禁令前获得的动物体内研究数据，或者是遵从其他（非化妆品）法规而获得的体内数据，如REACH法规（欧盟，2008年）。此外，高质量的电子显微镜图像可以提供纳米颗粒皮肤吸收情况的相关信息。

　　由于当前缺乏结果可重现、实验室内和实验室间结果可比较的标准化研究模型，使得研究纳米材料在受损皮肤上的吸收和作用存在一定挑战。有鉴于此，OECD（2011b）建议以完整皮肤进行研究。根据OECDTG428（OECD,2004a），体外皮肤吸收研究应使用完整健康的皮肤。在目前的体外皮肤渗透研究相关准则中（OECD,2004a;SCCS,2010a,2010b），也有关于执行皮肤完整性检查的建议。如果特别需要对受损皮肤进行研究，则所使用的模型应经过充分表征，确保结果可重现，并应在研究中加入适当的对照组。受损皮肤测试模型的开发仍需进一步研究，以期这些模型能够可靠地应用于评估化妆品原料（包括纳米材料）的潜在皮肤吸收。

　　对于没有（足够的）皮肤吸收数据的常规化妆品原料，SCCS根据文献调研结果假定其吸收率为50％。但是这种分析模式不适用于纳米材料。截至目前的研究只证明了纳米材料在皮肤上存在非常有限的吸收或者没有吸收。另一方面，SCCS也注意到特定的表面修饰可能提高纳米材料的透皮能力。有鉴于此，需要通过实验确定纳米材料的皮肤吸收情况（见指南附录一）。如果无法获得实验数据，SCCS将参照常规物质，以给药量的50％作为默认吸收值，或者根据纳米材料的特定组成采用更高的默认值。

　　途径二：吸入

　　一旦沉积到肺部，（部分）可溶性纳米材料就会（部分）溶解在上皮衬液（粘液层）中，而惰性纳米材料可能会在该部位形成不溶解的胶体悬浮液。巨噬细胞可以摄入纳米颗粒并通过黏膜纤毛将不溶解的纳米材料（单一的或团聚的但仍相对较小的纳米材料）运送到喉咽，从而发生纳米材料由气道的局部清除（Yangetal.,2008）。溶解在肺上皮衬液中的可溶性纳米材料可以转移至血液并分布到全身（Oberd?rsteretal.,2005）。其溶解度（溶解的速率和程度）取决于它的化学成分、尺寸、表面涂覆、稳定性和生物环境（Braakhuisetal.,2014）。

　　溶解度较低的纳米材料可能通过细胞介导的主动转运吸收方式从沉积部位穿过肺上皮并进入间隙部位，从间隙部位可能再转移到局部淋巴结，通过淋巴结进入血液，最终可能到达全身血液循环。纳米粒子也可能直接穿过肺泡中的肺屏障，从而由沉积部位直接进入到全身血液中（Bormetal.,2006）。

　　通过模拟肺泡屏障的体外细胞模型，即所谓的气液界面（ALI）模型，可以评估纳米粒子经肺部摄取以及进而发生系统暴露的可能性（Bachleretal.,2015）。该模型由一层膜组成，在膜的顶侧含有肺泡细胞并可能含有/不含有巨噬细胞，在膜的远侧含有内皮细胞。该模型的优势在于模拟了肺部的实际状况——在肺泡屏障的一侧，细胞暴露于空气中，而另一侧细胞则暴露于液体。通过喷雾形式施加被测试纳米颗粒，可以确保给药的均匀性以及与实际的符合性（Rothen-Rutishauseretal.,2008）。

　　其他研究人员也通过使用不同细胞组合，开展先进的体外研究，从而对该模型进行改良（例如微流体平台，详见Tenenbaum-Katanetal.,2018）。

　　如果存在系统性吸收的证据，则需要进一步研究确定所吸收的物质是以纳米颗粒形式还是以溶解/代谢形式存在。这可以通过实验研究或者纳米材料的溶解度/降解能力来加以说明。如果所提供数据不足以排除物质是以颗粒形式吸收，SCCS可能采用默认的方法，假定所吸收材料100%是以纳米颗粒的形式存在。

　　有关吸入吸收程度的信息应通过实验研究获得，和/或通过理化参数进行估计。但是，如果没有给出任何数据，对于常规化学品，SCCS会考虑以100％吸收率来计算吸入暴露量（SCCS/1602/18）。对于纳米颗粒经由肺部的吸收，如果缺乏数据，也会类似地采用肺部沉积量的100％作为默认吸收值。

　　途径三：经口

　　经吸入最初沉积在呼吸道的部分颗粒通过黏膜纤毛作用从肺和胸外气道转移至喉部，并主要通过吞咽进入胃肠道。

　　在胃肠道处纳米材料的溶解和/或降解是非常重要的过程，这个过程会减少纳米材料的系统摄入量。因此，在评估纳米材料经胃肠道的系统摄入量之前，应进行溶解和/或降解研究。根据EFSA（2018），以下参数可能表明纳米材料的纳米性能丧失或机体对纳米颗粒的低暴露率：

　　1.高溶出度（例如，在水、食物/食料基质或体液（如合成胃液或溶酶体液）中）；如果溶解浓度超过1mol/L，通常假定其具有高溶解度。

　　2.以高降解率降解为非纳米产物（例如，生物的或光催化的降解）。根据EFSA（2018），如果肠道阶段的降解速率曲线显示出存在的颗粒能够随时间明显减少（无稳定期），且在肠道消化30分钟后，12％或更少的物质（以质量为基础，并与体外消化开始时的颗粒物浓度进行比较）仍以颗粒形式存在，则认为该纳米材料具有高降解速率。这表示该材料的剩余部分将在胃肠道条件下完全降解为非纳米材料（例如离子）。

　　3.以聚集体而不是以团聚体的形式存在（例如，由生产制备条件决定）。

　　4.固定和永久结合于基质中（例如，基质的稳定性、结合的类型、寿命终止行为）或有效滞留在食品接触材料（FCM）中（例如，聚合物纳米复合材料）。

　　当没有降解和溶解数据时，SCCS将假定摄入的物质100％以颗粒形式存在。

　　迄今为止，没有通过验证的纳米材料经口吸收体外模型。可以使用关于经口吸收的已有体内研究数据，但前提是数据在动物试验禁令之前获得，或者为了遵从其他（非化妆品）法规而获得，例如REACH（欧盟，2008年）。

　　文献报道的体外模型包括使用Caco-2细胞以及更复杂的膜上培养多细胞模型（Bouwmeesteretal.,2011）。

　　2006年ICRP开发了人体消化道模型（HATM），该模型可用于计算胃肠道中的颗粒剂量。该模型描述了颗粒通过食入进入口腔或经呼吸道转运进入食道的过程。它描述了通过所有消化道区域（包括口腔、食道、胃、小肠、结肠段以及随粪便排出）的依次转移。在该模型中，颗粒的部分比例由消化道转移因子表示，该因子描述了从消化道所有区域的总吸收，尽管默认假设为所有吸收均发生在小肠中。

　　一般认为常规化学品的系统吸收量不超过口服剂量的50%。因此，当没有相关数据时，将50％的给药剂量作为化妆品原料的默认经口吸收量，并且以POD的二分之一作为PODsys（详见后续章节）。如果有数据表明经口生物利用度较差，可以以10%作为默认经口吸收量（SCCS/1608/2018）。由于其溶解度特点，纳米材料的口服吸收量被认为可能更低。因此，只要存在经口吸收或其他剂量指标的数据，就应使用。同时也应考虑材料的体外异位/迁移数据以及任何其他可用的动力学数据。

　　当可获得有关纳米材料的溶解和/或降解的数据时，未溶解/降解部分可以作为计算默认吸收量的初始值。

　　对于纳米材料的暴露评估，原则上可以采用与常规物质相同的暴露场景和评估方法。但是，纳米材料在消费者实际使用过程中可能与实验室条件下有所不同（例如，可变的和稳定的粒径分布），因此可能需要研究更多的实验条件。应以质量/每体积的度量形式进行暴露量的估算。此外，在特定情况下，还应提供其他指标，例如颗粒数量和尺寸分布以及表面积等。

　　纳米材料在进入体内的过程中可能在内部暴露部位发生降解或溶解。例如，纳米材料口服后可能在胃肠道中完全溶解。应使用合适的体外方法证明这一点。在缺乏相关数据的情况下，SCCS将假定纳米材料不发生溶解。

　　纳米材料与（可溶性）物质在吸收和生物动力学行为方面受不同的过程支配，纳米颗粒是基于胞吞作用或其他主动跨膜转运机制实现跨生物屏障转运，而非基于扩散梯度驱动。可以通过先进的二维（2D）和三维（3D）多细胞共培养体外模型评估跨不同生物屏障的纳米材料摄入量，该类模型用于高度模拟体内器官和屏障（例如肺、肺泡和胃肠道）的体内解剖结构和功能。

　　当有证据表明存在纳米材料的系统吸收，并且不能通过实验手段或通过纳米材料的溶解/降解排除纳米颗粒的吸收，则SCCS将采用默认方法，即假定所吸收材料100%是以纳米颗粒的形式存在。

　　其他适用于吸收量的默认值：在没有实验数据的情况下，SCCS将以当前常规物质所采用的给药剂量的50％作为默认皮肤吸收值；也可能基于纳米材料的某些特定组成，采用更大的默认值。对于喷雾类产品和挥发性化妆品原料的吸入暴露量，在没有吸收数据的情况下，将以所计算的肺中纳米颗粒沉积量的100％作为默认吸收值。对于经口吸收，在没有吸收数据的情况下，将采用给药剂量的50％作为默认吸收值；如果有信息表明经口生物利用度较差，也可考虑以给药剂量的10%作为默认值。

　　﹝本文翻译自译文《化妆品中纳米材料安全评估指南》——欧盟消费者安全科学委员会（2019年10月版）﹞

　　（深圳市药品检验研究院刘杵胜，王晓炜；中国食品药品检定研究院化妆品安全技术评价中心苏哲，王钢力；中国科学院长春应用化学研究所张海元）

(责任编辑：庞雪)