当前，高通量测序技术（也称为二代测序技术）迅猛发展，已逐步广泛应用于基因检测的多个方面的临床服务，其对于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和小于50bp的插入或缺失（Insertion-Deletion，InDel）变异检测相对较为准确，但是对于大的结构变异检测却非常困难。同时，另一类以不经过扩增的单分子测序和长读长为标志的DNA测序技术也随即问世，这类测序技术被称为第三代测序技术，因其测序时DNA分子无需PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，也称为单分子测序技术。

　　技术平台

　　Helicos公司于2008年推出了世界上第一款单分子测序平台HeliScope，但其读长较短（35bp），系统整体测序错误率较高（5%）。随后出现了单分子的长读长测序技术，目前长读长测序是指单分子测序长度不少于KB级别测序读长的技术平台。目前，已经实现商业化的长读长测序平台主要有Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔测序（Nanopore）平台和PacBio公司的单分子实时测序（SMRT）平台。

　　单分子实时测序技术（SMRT）

　　PacBio公司开发的第三代测序技术称为SMRT测序（Single Molecule Real-Time Sequencing），该技术建立在两项重要的发明基础之上，从而攻克了测序领域测序读长短的重大难题。零模波导孔技术（Zero-mode Waveguides，ZMWs）使激发光被限定在单分子纳米孔底部一定范围内，过滤了背景噪音；荧光基团结合在核苷酸的磷酸基团上，帮助DNA聚合酶完成一个全天然的DNA链合成过程。

　　基于该原理的具体产品有PacBio Sequel测序仪、PacBio SequelII测序仪。PacBio Sequel测序仪是首个商业化应用的第三代测序技术平台，其打破了传统短读长测序诸多技术瓶颈。PacBio SequelII测序仪是PacBio Sequel的升级款，可提供CLR Library和CCS library（HIFI）两种测序模式。测序芯片上的导孔（ZMW）由100万个提升至800万个，理论通量提升了8倍。CCS reads单碱基准确性也有了极大提升，同一片段测序4次后，单一read的准确性可达99%。

　　纳米孔单分子测序技术（Nanopore）

　　纳米孔单分子测序是基于电信号测序的技术，原理是通过电场力驱动单链核酸分子穿过纳米尺寸的蛋白孔道，由于不同的碱基通过纳米孔道时产生了不同阻断程度和阻断时间的电流信号，可根据电流信号识别每条核酸分子上的碱基信息，从而实现对单链核酸分子的测序。由于该测序技术的原理与其他平台有较大差异，亦有被称为第3.5代或第四代测序技术。

　　Nanopore测序仪的具体产品种类很多，均为基于Nanopore芯片来搭建的平台，大到由多个芯片阵列组成的PromehION、GridION系列测序仪，小到可以连接手机Type C、电脑USB的MnION系列便携式测序仪。其中，PromethION是一款高通量、高样本数的台式系统，基于模块化设计（多达48个测序芯片，各有多达3,000个纳米孔通道，总计达14.4万个纳米孔通道），测序芯片既可单独也可同时运行，尤其适合于大样本量、具有庞大数据量的项目。

　　第三代测序平台特点比较

　　上述两类第三代测序平台均具有长读长、无GC偏好性及可直接检测甲基化修饰等优点。相较而言，纳米孔单分子测序技术读长更长，可达到Mb级别，其中MnION测序仪如手机大小，较为便携；单分子实时测序技术（SMRT）平台，无错误偏好，可通过增加数据纠错以提高测序准确性。具体的比较如下表所示。

　　应用方向探索

　　目前，长读长测序的三代测序平台已广泛应用于复杂动植物基因组、微生物基因组、全长转录组、微生物群体研究及人类基因组变异检测等领域的科研项目中，以解决这些科研领域检测技术的瓶颈问题。

　　在疾病检测方面，三代测序基于其单分子检测与长读长测序的特点，在基因组结构变异、短串联重复/微卫星、单体型分析、真假基因区分、甲基化检测等相关的检测中具有独到的优势。例如，目前许多基于高通量测序技术的基因诊断产品已基本成熟；但因二代测序技术存在读长短、对基因组覆盖不均匀等局限，对SNVs和InDels检测尚可，对复杂结构变异的检测却无能为力。第三代测序技术用于遗传病及肿瘤基因的检测，凭借长读长、无PCR、无GC偏好性等优势，能够进行长片段序列测定，可以检测缺失、重复、倒位、易位等结构变异（＞50bp），可进一步提高疾病的检出率，有效弥补二代测序技术对结构变异检测的不足。

　　相较于二代测序，三代测序平台将读长提升了万倍，但由于其错误率、成本及样本要求都较高，算法、软件、数据库等配套技术仍需进一步研究，目前尚处于科研项目应用阶段。针对这些问题，各技术平台也在不断优化技术，如PacBio测序仪的HIFI技术模式可有效提高数据准确性，纳米孔测序平台也通过对PromethION进行设备上的升级以提高准确度。

　　随着三代测序平台的不断发展，其在医学领域的转化应用，或将有效弥补目前基于结构变异、短串联重复/微卫星、单体型分析等变异的基因相关疾病检测手段的空白。

　　（作者单位：国家药监局医疗器械技术审评中心）

(责任编辑：谯英固)